外泌體是什么？ |外泌體分離的方法與差異

外泌體是細胞釋放的微小囊泡，因為含有生物分子如蛋白質和DNA、RNA序列，所以能夠影響周圍細胞的功能，在細胞間通訊和疾病機制中扮演關鍵角色。 透過了解外泌體分離的方法，我們能夠研究細胞間訊息傳遞的機制，從而揭示許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

什么是胞外囊泡/外泌體？

細胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs） 是由細胞分泌而形成，是一種無法自行復制的生物納米球狀脂雙層囊泡結構。 這些囊泡存在于多種生物體液中，如唾液、尿液、血液、血清、腦脊液、乳汁等，也可能出現(xiàn)在細胞培養(yǎng)液中。
細胞外囊泡包含多種訊號因子及生物標記，如核酸、蛋白質、脂質，可作為細胞間信號傳遞、溝通的媒介，調控生理與病理機制。 根據(jù)尺寸及生物起源的不同，胞外囊泡可分為外泌體 （exosomes）、微囊泡 （microvesicles， MVs） 及凋亡小體 （apoptotic bodies） 三大類別。

胞外囊泡/外泌體之命名與生物起源

值得注意的是，由于各種細胞外囊泡的生物起源難以明確判別，因此國際胞外囊泡協(xié)會（International Society for Extracellular Vesicles， ISEV）于 MISEV2018指南中，建議改以下列方式命名：

不同的外泌體種類命名方式

外泌體來源

相較于脂質體、奈米粒子等合成載體，外泌體來源具有內源性及異質性等特性，使得外泌體可作為優(yōu)良載體，能透過多種途徑和位點將具有生物活性的物質運送至目標細胞參與調節(jié)，如組織修復、免疫調節(jié)、血管新生、細胞分化、腫瘤形成等。

因此，外泌體在疾病診斷、*和生物研究方面，具有很大的潛力及優(yōu)勢，如作為腫瘤診斷的生物標記、癌病*的藥物載體等。

外泌體缺點

然而，外泌體也存在著一些限制，如低穩(wěn)定性、低產(chǎn)量、低純度以及弱標靶性等因素，都可能會限制其臨床應用。

外泌體分離的方法與差異

隨著對外泌體的研究不斷深入，其潛在應用價值也持續(xù)不斷地被發(fā)掘。 外泌體的分離、純化及濃縮（又稱富集，enrichment）對于評估其生物學功能及其下游應用至關重要。

然而，外泌體萃取因生物樣品的成份復雜，內含許多相似的分子結構，如細胞碎片、蛋白聚集體、脂蛋白等，且外泌體的大小、組成具有異質性，使得外泌體分離更具有挑戰(zhàn)性。 因此，如何有效地分離與濃縮外泌體是學術研究及臨床應用中面臨的一大考驗。

常見的外泌體分離方式比較

外泌體分離的方法很多種，依原理不同，常見方法為超速離心法、粒徑篩析層析法、超過濾法、沉淀法和免疫親和法，下表統(tǒng)整了各方法的差異：

*1超速離心法 （UC）又稱為差速心法 （Differential ultracentrifugation， dUC）
*2使用專業(yè)純化 kit 可于20分鐘內完成EVs純化
*3高擴展性是指 TFF 切向流過濾法 （ Tangential Flow Filtration)

傳統(tǒng)超濾與切向流過濾的優(yōu)劣勢分析

超過濾法 （UF） 是以分子大小進行分離的方法，其中又可細分為以離心驅動的超濾離心管、壓力驅動的攪拌式過濾器及切向流過濾 （tangential flow filtration， TFF） 三種類型。
超濾離心管及攪拌式過濾器的作簡單、處理時間快，但*的問題是濾膜易堵塞 （clogged），不僅降低分離效率且成本高; 而切向流過濾技術 （TFF） 的發(fā)展則可大幅解決濾膜堵塞的問題。

TFF切向流過濾技術用于外泌體分離

多篇文獻也指出TFF用于EVs分離時，不論產(chǎn)量、再現(xiàn)性、去污染能力都比稱為EV純化的黃金標準的超速離心法（UC or dUC）來得*，甚至節(jié)省了40%以上的時間，更適合大規(guī)格量產(chǎn)的應用。
各方法的詳細比較及TFF &UC的EV分離數(shù)據(jù)，可觀看'EXOSOME外泌體純化在線研討會直播精華'。

盡管現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出各種外泌體分離方法，但這些方法仍存在缺點，無法完全滿足分離外泌體的高純度及高產(chǎn)率需求。 為了提高外泌體的分離效率和濃縮程度，許多研究團隊已經(jīng)開始嘗試結合多種分離方法; 截至目前，已有研究指出，多種分離方法比單一分離方法能更有效地提高產(chǎn)量和純度。 例如，結合 UC 和 UF 初步萃取外泌體，再利用 IA 進一步純化目標外泌體。 或者可以結合 UC 和 SEC，不僅可以處理大體積樣品，還可以有效減少污染物的干擾。 在選用結合方法時，應注意各別單一方法對目標外泌體是否會造成不良影響，如外泌體變性、失活等問題。 以下為 TFF 搭配各種技術進行外泌體的分離方法。

*LSC：Low speed centrifugation，低速離心法

外泌體的應用

• 疾病診斷/預后：作為生物標記用于精準醫(yī)療及預測病程，如阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、自體免疫疾病、神經(jīng)退化性疾病、癌癥等
• 疾病* ：分子藥物、*劑、藥物載體及傳遞用于癌癥*及再生醫(yī)學等領域
• 生物研究：DNA、miRNA 等，了解各疾病的生理及病理機制

參考文獻：

• A Review of Exosomal Isolation Methods: Is Size Exclusion Chromatography the Best Option, Sidhom et al., International Journal of Molecular Science, 2020
• Biological Functions Driven by mRNAs Carried by Extracellular Vesicles in Cancer, Prieto-Vila et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021
• Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications, Zhang et al., International Journal of Nanomedicine, 2020
• Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods, Stam et al., Journal of Chromatography B, 2021
• Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018)-a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, Journal of Extracellular Vesicles, 2018
• Multiplexed strategies toward clinical translation of extracellular vesicles, Song et al., Theranostics, 2022
• Progress in Exosome Isolation Techniques, Li et al., Theranostics, 2017
• Review on Strategies and Technologies for Exosome Isolation and Purification, Chen et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022